筛选两万个人类基因，耶鲁团队发现介导蛋白，采用“洗衣液”原理规避耐药性，直接杀灭侵...
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为什么感冒的时候，吃了很多药病情却不见好转？最主要原因之一，是人们长期食用抗生素类型的感冒药，使人体中许多病原体产生抗药性。在免疫学中，如何高效的杀死革兰氏阴性菌、如沙门氏杆菌（Typhimurium）等具有很强抗药性的细菌，是一件令人头痛的问题。
近日，耶鲁大学医学院研究团队发现了一种名为 “APOL3（Apolipoprotein L3）” 的介导蛋白，该蛋白可以像商场中售卖的 “洗手液” 去污一样，简单粗暴地将入侵人体内的病原微生物杀死，还不会对人体自身造成伤害。
（来源：Pixabay）
该团队将研究目光聚焦在人体内自身的自主免疫系统，研究发现该系统中 “干扰素刺激蛋白” 能够以简单高效的方式，将病原微生物清除。
7 月 16 日，相关论文以题为《具有类似洗涤剂的活性人体介导蛋白 L 可杀死细胞内病原体》（A human apolipoprotein L with detergent-like activity kills intracellular pathogens），发表在国际期刊 Science 上。
图｜相关论文（来源：Science）
该研究由耶鲁大学医学院霍华德休斯医学院博士后瑞安・高德（Ryan Gaudet）、耶鲁大学系统生物学研究所博士后朱世伟，耶鲁大学医学院微生物发病机理学和免疫生物学副教授约翰・麦克米金（John D. MacMicking）主导。
图｜朱世伟（来源：受访者）
该研究成果揭示了 APOL3 可以通过其两亲螺旋以及跨膜结构域直接和细菌内膜中的磷脂成分结合，并形成具有动态属性的纳米磷脂环，就像 “洗手液” 去污一样将细菌内膜磷脂溶解，破坏细菌内膜的完整性，导致细菌的死亡。
图｜负染电子显微镜显示 APOL3 直接破坏细菌内膜（来源：受访者）
所以，只要 APOL3 蛋白有机会接触到病原细菌的内膜，就可以用简单粗暴的方式将侵入人体的细菌杀死。
病原细菌的抗药性是难以解决的科学问题之一。该研究一针见血地强调，人类自身可以进化出简单高效的自我防卫策略 APOL3 天然 “去污剂”。体内增强 APOL3 的表达水平与体外抗生素结合使用，对于治疗具有耐药性病原菌感染具有潜在应用价值。
对 20000 个人类基因进行筛选，进一步阐明 APOL3 的抗菌机制
人体细胞内储存了丰富的营养物质，因此自然界中许多病原微生物、细菌、寄生虫选择在细胞内增殖。
过去人们普遍认为机体主要靠免疫细胞来清除细菌感染。然而，近年来发现表明，占机体绝大多数的非免疫细胞也可以通过细胞自主免疫（Cell Autonomous Immunity）来迟滞和清除侵入细胞内的病原体。
II 型干扰素（IFN-γ）通过上调大量干扰素刺激基因 (ISGs，Interferon Stimulated Genes) 的表达，在调控细胞自主免疫中扮演了重要角色，但里面有很多基因功能及其抗菌机制并没有被揭示。为了找到非免疫细胞中抵御细胞内细菌感染的关键基因，该团队采用 CRISPR/Cas9 系统对 20000 个人类基因进行了筛选。
图｜CRISPR-Cas9 技术对 APOL3 的筛选示意图（来源：受访者）
首先，用慢病毒搭载 Cas9 以及全基因组 sgRNA（single guide RNAs）文库对 HeLa 细胞进行转导；
其次，使用干扰素激活这些细胞中 ISGs 的表达，并进一步用荧光标记过的沙门氏菌去感染这些 HeLa 细胞；
最后，通过流式细胞术（FACS，Fluorescence-Activated Cell Sorting）分选出沙门氏菌高度增殖的 HeLa 细胞群体，并通过高通量测序鉴别出特异富集在这一细胞类群中的 sgRNA。
该团队运用了全基因组 CRISPR/Cas9 筛选体外脂质体实验，揭示了非免疫细胞的全新自我防御机制。
朱世伟向 DeepTech 表示，“首先，我们发现 APOL3 能够显著抑制诸如沙门氏菌在内的胞内病原菌增殖。其次，我们采用高分辨荧光显微镜、负染电子显微镜、冷冻电子显微镜以及质谱等多种手段进一步阐明了 APOL3 的抗菌机制。”
该团队之所以选择 “沙门氏杆菌” 作为研究载体，是因为它对于此项研究工作的推动有实质性帮助。
第一，沙门氏菌是一种常见的食源性病原微生物，能够引起食物中毒。中毒情况严重时，可导致误食者死亡。阐明沙门氏菌与宿主细胞的相互作用，有助于我们预防以及治疗其引起的疾病。
第二，沙门氏菌是研究细胞内感染机制的重要模式生物，科学界对沙门氏菌本身的生理特性有着相对完善的认知，也开发了研究诸如突变菌株、基因表达菌株等细菌的多种工具。
结果显示：针对 APOL3 基因的数个 sgRNA 在其中高度富集，提示敲除 APOL3 会引起沙门氏菌在 HeLa CCL2 细胞内过度增殖。
体内 “洗手液” APOL3，可以简单粗暴的方式将侵入性细菌杀死
朱世伟向 DeepTech 表示，“我们这篇研究的亮点之一，是再次提出人体表皮、上皮各种细胞都具有防疫免疫功能，我们发现如果 II 型干扰素受到外援细菌入侵，它的表达就会升高，会自动调动人体的一些相关的基因。”
图｜APOL3 可以将细胞内的病毒杀死（来源：受访者）
该团队通过活细胞显微成像技术对 APOL3 进行了跟踪，发现 APOL3 能够迅速转移至暴露的细菌中，这是 APOL 其他蛋白所不具备的特征。超分辨荧光成像显示当 APOL3 靶向 IFG-g 激活细胞内的病原体时，会对细菌内膜造成致命的伤害。
譬如，在治疗由病原菌感染引起的病患时， 由于很多病原菌具有抗生素抗药性，所以抗生素很难将它们彻底杀死。在这种情况下，先对患者的免疫系统进行调控是一种行之有效的办法。当患者的自身免疫能力提高，就能够有效将这些具有抗药性的病原体杀死。
然而，APOL3 作为一种强效的杀菌武器是受严格调控的。在静息状态下，APOL3 的表达量非常低。当细菌入侵时，人体会分泌出干扰素 IFN-γ 作为一种警示信号诱导细胞大量表达 APOL3 以及其他相应蛋白。APOL3 需要与鸟苷酸结合蛋白（GBP1，Guanylate-Binding Protein 1）蛋白协同作用，以发挥最大功效，从而击穿细菌外膜脂多糖，帮助 APOL3 接触到细菌内膜直接将侵入人体的细菌杀死。
图｜负染电子显微镜显示 APOL3 和纳米磷脂环的形成（来源：受访者）
APOL3通过更加高效地结合并溶解细菌内膜的酸性磷脂组分，像 “去污剂” 一样简单粗暴地将细菌杀死，这一研究结论增强了人们对非经典免疫系统的认知。
但是，IFN-γ 在非免疫细胞和组织中所赋予的抵抗力至今仍难以捉摸。
首先，由于非免疫细胞常常被视为与免疫系统无关而得不到重视。其次，在上皮细胞中，IFN-γ 信号介导刺激大量相关的基因产物表达，其中很多基因表达产物的功能及其抗菌机制并没有被揭示。因此，IFN-γ 在非免疫细胞和组织介导免疫防御机制仍难以捉摸。
进一步探索人免疫系统的奥秘，让患者远离抗生素
朱世伟做了一个形象生动的比喻，“APOL3 与病原体有点像中国文化里的‘道和魔’此消彼长，整个免疫系统又像一个宇宙，有许多奥秘需要探索，除了洗手液 A，可能还有洗手液 B 或者 C，本次研究仅仅是一个开端，后面还有很多宝藏有待挖掘。”
就人体细胞而言，还有其它的 IFN-γ 信号介导效应蛋白有必要了解，其它的效应蛋白也有着类似 APOL3 的抗菌功能。“我需要分别从细胞和分子水平上，解析类似 APOL3 相关蛋白的结构，进一步揭示抗菌机制。” 朱世伟告诉 DeepTech。
由于病原菌病原体的进化速度远远快于抗生素的发明和新型类抗生素的寻找，当患者受到抗药性病原菌感染之时，有针对性地增强患者自身干扰素介导的效应蛋白表达，或许是对抗抗药性病原菌感染，挽救患者生命的另一种可行方案。
接下来，该团队将研究还有哪些干扰素刺激基因蛋白真正参与了直接杀菌；比如，该团队目前所关注的鸟苷酸结合蛋白，是如何识别病原微生物外膜并将其破坏掉的；是否可以采用体外重构的方式来模拟多种干扰素介导的效应蛋白协同工作，消灭病原微生物；是否可以利用冷冻电镜在细胞和分子水平上揭示这些效应蛋白的杀菌机制。这将是该团队未来 2~3 年内攻克的主要难题。
打破前进道路中的 “枷锁”，勇攀科研高峰
据悉，朱世伟博士期间专注于细菌学领域中鞭毛马达组装与结构的研究，为了获得原位鞭毛马达 3D 结构信息，朱世伟飘洋过海到耶鲁大学学习冷冻电子显微镜、冷冻电子断层扫描以及后期图像处理技术。后来，他发表了细菌鞭毛马达一系列的原位 3D 结构 （PNAS，114 （41），10966-10971）。
“结合我的细菌学背景以及所掌握的冷冻电镜及后期图像处理技术，我选择了细菌学和免疫学互相交叉的细胞自主免疫作为主要研究方向。使用冷冻电子断层扫描技术和冷冻电镜单颗粒技术，分别在细胞和原子水平上，揭示解析细胞自主免疫过程中 IFN-γ 信号介导的相关效应蛋白抗菌机制。” 朱世伟告诉 DeepTech。
最近，该团队首次发现了植物可以通过相分离的方式来增强自主免疫防御。朱世伟利用冷冻电子断层扫描技术，第一次在原位上捕捉到相分离的结构，并以此为依据提出了以相分离为介导的植物自主防御模型 （Nature 594 (7863), 424-429）。真核生物可以采用多种多样的策略去抵抗病原菌入侵，这一系列研究结果拓宽了朱世伟对自主免疫防御的认知。
朱世伟向 DeepTech 表示，“科研之路挑战在所难免，我们要勇于打破前进道路上的枷锁，永攀科学高峰，为推动该研究领域的蓬勃发展提供一份力量。”
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